Tłumaczenie oryginalnego artykułu: Vinay Bhardwaj, Krati Sharma, Srdjan Maksimovic, Aixing Fan, Alison Adams-Woodford, Junhong Mao, Professional-Grade TCA-Lactic Acid Chemical Peel: Elucidating Mode of Action to Treat Photoaging and Hyperpigmentation, Front Med (Lausanne) 2021 Feb 12;8:617068.
Źródło: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7928281/
Streszczenie
Peeling chemiczny jest zazwyczaj wykonywany przez dermatologów, chirurgów plastycznych i kosmetologów w leczeniu skóry fotostarzejącej się, skóry z przebarwieniami, skóry skłonnej do trądziku oraz zmian przedrakowych itp. W niniejszym artykule badawczym przedstawiamy wyniki naszych badań, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania komercyjnego, profesjonalnego peelingu chemicznego w leczeniu skóry z hiperpigmentacją i fotostarzeniem. W eksperymentach in vitro odkryliśmy, że peeling hamuje enzymy odpowiedzialne za degradację kolagenu i elastyny oraz produkcję pigmentu melaniny. Zaskakujące było zaobserwowanie, że kwas trichlorooctowy (TCA), uważany za „konia roboczego” peelingów chemicznych ze względu na swoje działanie kauteryzujące, może synergistycznie wzmacniać hamujące działanie kwasu mlekowego. Uzasadnieniem tego synergicznego efektu może być zmiana konformacji TCA ze struktury liniowej na pierścieniową, co zostało wyjaśnione poprzez sekwencyjne dokowanie za pomocą oprogramowania Rosetta. Wyniki badań in vitro dotyczące kolagenu i elastyny zostały potwierdzone zwiększoną ekspresją genów COL1A, COL3B, fibronektyny i elastyny w trójwymiarowych odpowiednikach ludzkiej skóry poddanych peelingowi. Odkrycia te zostały dodatkowo potwierdzone w testach ex vivo na biopsjach ludzkiej skóry. Peeling znacząco hamuje produkcję całkowitej melaniny i łagodzi uszkodzenia fotouszkodzeń, które były widoczne poprzez naprawę kolagenu w skórze wystawionej na biologicznie skuteczną dawkę dziennego światła UV (6 J/cm²). Wyniki tych badań mają znaczenie dla twórców produktów i użytkowników (dermatologów, chirurgów plastycznych i kosmetologów) w zakresie poprawy bezpieczeństwa i skuteczności peelingów chemicznych.
Słowa kluczowe: peeling chemiczny, dokowanie molekularne, melanina, kolagen, antypigmentacja, fotostarzenie
Wprowadzenie
Peeling chemiczny to niechirurgiczny zabieg dermatologiczny, najczęściej wykonywany przez licencjonowanego specjalistę w spa medycznym lub lekarza w jego klinice. Według badań przeprowadzonych w 2019 roku, Amerykańskie Towarzystwo Chirurgów Plastycznych (1) i Amerykańskie Towarzystwo Chirurgii Plastycznej Estetycznej (2) wymieniają peeling chemiczny jako jeden z najpopularniejszych małoinwazyjnych zabiegów niechirurgicznych w Stanach Zjednoczonych. Zabieg ten polega na użyciu substancji chemicznych w celu złuszczania martwych lub uszkodzonych komórek z powierzchni skóry metodą „chemoeksfoliacji”, odsłaniając nowe i zdrowe komórki w procesie zwanym obrotem komórkowym lub odmładzaniem skóry. Chociaż użytkownik niekoniecznie doświadczy widocznego złuszczania po peelingu, składniki aktywne zawarte w peelingach nadal działają na poziomie komórkowym. Leczenie uszkodzeń słonecznych (fotostarzenia) i nierównomiernej pigmentacji skóry (dyspigmentacji) to dwa główne wskazania do interwencji peelingu chemicznego (2, 3). Chociaż w ostatnich latach opracowano nowe techniki złuszczania, takie jak laser, dermabrazja itp., peeling chemiczny pozostaje najpopularniejszy ze względu na minimalne skutki uboczne, łatwość wykonania i stosunkowo niższy koszt (3). Kwas trichlorooctowy (TCA) i alfa-hydroksykwasy (AHA) to dobrze znane składniki peelingów chemicznych ze względu na ich właściwości żrące i złuszczające (4–6). Oprócz wspomnianego mechanizmu działania, polegającego na złuszczaniu, inną teorią stojącą za peelingami chemicznymi jest ich zdolność do indukowania kontrolowanego gojenia się ran lub urazów poprzez kwaśne działanie, pobudzając w ten sposób system obronny skóry do stymulacji kluczowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, elastyna i kwas hialuronowy. To kwaśne działanie może być naszym wrogiem lub sprzymierzeńcem, w zależności od stężenia kwasów stosowanych w peelingu (5).
Aby osiągnąć pożądaną głębokość i korzyści przy minimalnych efektach ubocznych, zaleca się stosowanie TCA w niższym stężeniu, łącząc go z innymi środkami złuszczającymi, takimi jak roztwór Jessnera i/lub hydroksykwasy (7). Na przykład, powierzchowny peeling składający się z <30–35% TCA i 10–70% hydroksykwasów (alfa i/lub beta) może osiągnąć głębokość penetracji do skóry brodawkowatej i może leczyć łagodne fotostarzenie, blizny potrądzikowe i zaburzenia pigmentacyjne (3, 7–9). Chociaż brakuje literatury na temat niekorzystnych skutków peelingów chemicznych na bazie TCA, istnieje możliwość wystąpienia pozapalnej hiperpigmentacji i oparzeń kwasem (7). Dlatego peeling powinien być wykonywany przez przeszkolonego specjalistę lub lekarza, a opieka pooperacyjna powinna być przestrzegana, aby zapobiec powikłaniom związanym ze środkami złuszczającymi (7). Typowy schemat opieki pooperacyjnej obejmuje stosowanie delikatnego oczyszczania, maści Aquaphor, nawilżania i stosowania kremu z filtrem przeciwsłonecznym w celu ochrony i odżywienia złuszczającej się skóry (9). Chociaż nie ma uniwersalnego protokołu, wielu dermatologów preferuje stosowanie miejscowych retinoidów, takich jak tretinoina i retinol, hydrochinon itp., przed i po peelingu, aby osiągnąć optymalne rezultaty i bezpieczeństwo (7, 8, 10). Ryzyko powikłań i opieki pooperacyjnej jest minimalne w przypadku peelingów powierzchniowych. TCA jest najczęściej stosowany w połączeniu z AHA, takimi jak kwas mlekowy i kwas glikolowy (7), ponieważ mechanizm działania AHA i ich wskazania są dobrze poznane (11, 12). AHA są wskazane do stosowania w wielu domowych i dermatologicznych produktach kosmetycznych i medycznych do nawilżania skóry, redukcji zmarszczek i przebarwień oraz peelingów chemicznych (3, 12). Niedawno kwas mlekowy wyłonił się jako bezpieczniejsza alternatywa dla złotego standardu kwasu glikolowego, bez uszczerbku dla skuteczności. Kwas mlekowy jest strukturalnie podobny do kwasu glikolowego, z różnicą dodatkowej grupy metylowej oraz niższym pKa i pH niż kwas glikolowy (3). Zatem niższe pH kwasu mlekowego oznacza, że do osiągnięcia równoważnej skuteczności (keratokoagulacji) wymagane jest jego znacznie niższe stężenie niż kwasu glikolowego. Neutralizacja kwasem mlekowym nie jest konieczna, a czas rekonwalescencji jest krótki (3). W zależności od stężenia kwasów w peelingu, peelingi chemiczne można ogólnie podzielić na domowe, profesjonalne i przeznaczone wyłącznie do użytku lekarskiego. Stężenie lub moc składników aktywnych w peelingach profesjonalnych i lekarskich jest na poziomie recepturowym i dlatego nie są one dostępne w sprzedaży detalicznej ani do użytku domowego. W zależności od stanu skóry i jej wrażliwości, dermatolog wybierze peelingi profesjonalne lub lekarskie o jednej z trzech głębokości: (1) peelingi powierzchniowe, które zazwyczaj nie wnikają poza warstwę brodawkowatą skóry właściwej i zazwyczaj zawierają składniki aktywne, takie jak TCA w stężeniu <30–35% (3, 7–9) i często w połączeniu z innymi środkami złuszczającymi, takimi jak alfa- lub beta-hydroksykwasy oraz retinoidy, takie jak tretinoina i retinol itp. w niskich stężeniach (10, 11), (2) peelingi średniogłębokie, które wnikają do warstwy brodawkowatej skóry właściwej, zwykle zawierające kwas trichlorooctowy (TCA) w niskim do średniego stężeniu, oraz (3) peelingi głębokie, które wnikają do środkowej warstwy siateczkowatej skóry właściwej i zwykle zawierają fenol lub TCA w średnim do wysokiego stężeniu (3). TCA pozostaje koniem roboczym peelingów chemicznych w dermatologicznym standardzie opieki ze względu na jego dobrze poznany kauteryzujący sposób działania, ułatwiający penetrację do głębszych warstw skóry i udowodnione bezpieczeństwo (4). Chociaż peelingi TCA i AHA z dodatkiem TCA pozostają standardem dermatologicznym w leczeniu szerokiego spektrum schorzeń skóry, od dyschromii pigmentacyjnych po fotostarzenie, niewiele wiadomo na temat aktywności TCA poza jego działaniem kauteryzującym i interakcją z AHA. Celem niniejszych badań jest zbadanie sposobu działania powierzchniowego peelingu chemicznego TCA-AHA w leczeniu pigmentacji i fotostarzenia.
W niniejszej pracy badawczej zbadaliśmy (1) skuteczność komercyjnego, profesjonalnego peelingu chemicznego TCA-kwas mlekowy w leczeniu skóry z przebarwieniami i fotostarzenia, (2) synergistyczne działanie hamujące między TCA a kwasem mlekowym oraz (3) mechanizm hamowania poprzez dokowanie molekularne.
Metody
Peeling komercyjny uzyskano od firmy PCA Skin®. Biopsję skóry ludzkiej pobrano w wyniku operacji plastycznej jamy brzusznej, po uzyskaniu świadomej zgody dawcy.
In vitro: Testy hamowania enzymów
Testowany produkt (peeling chemiczny) i jego główne składniki aktywne (TCA i kwas mlekowy) testowano w bardzo niskim stężeniu i po zneutralizowaniu pH. Przed testem rozcieńczeń seryjnych peelingi rozcieńczano 10-krotnie. Do testu synergii przygotowano nierozcieńczone roztwory robocze TCA, kwasu mlekowego i ich mieszaniny w stosunku 1:2, tj. 0,312% TCA i 0,625% kwasu mlekowego. Roztwory robocze rozcieńczano seryjnie w celu zbadania synergii w trzech dawkach. Peeling i składniki aktywne przetestowano przy użyciu zestawów Sigma Aldrich pod kątem ich aktywności hamującej tyrozynazę (enzym odpowiedzialny za produkcję pigmentu melaniny, nr katalogowy MAK257), kolagenazę (enzym odpowiedzialny za degradację kolagenu, nr katalogowy MAK293) i elastazę (enzym odpowiedzialny za degradację elastyny, nr katalogowy MAK213), zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, do roztworów enzymów dodano kontrolę pozytywną i próbki testowe i pozostawiono do inkubacji przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Kontrolę enzymatyczną (kontrolę negatywną) przygotowano, dodając bufor w miejsce próbek testowych. Po inkubacji dodano roztwór substratu i natychmiast odczytano płytkę 96-dołkową za pomocą czytnika płytek (Spectramax M5e firmy Molecular Devices, USA) przy 510 nm dla tyrozynazy, 345 nm dla kolagenazy i 400Ex/505Em dla elastazy neutrofilowej. Odczyty wykonywano co 5 minut przez co najmniej 30 minut, aby wykreślić krzywą kinetyczną i uzyskać jej nachylenie. Procent względnego hamowania w stosunku do kontroli enzymatycznej obliczono za pomocą następującego równania: [(Nachylenie krzywej kontroli enzymatycznej – Nachylenie krzywej próbek testowych)/nachylenie krzywej kontroli enzymatycznej] × 100. W celu walidacji wyników przeprowadzono badanie zależne od dawki (rozcieńczenia seryjne) oraz kontrole pozytywne. pH wszystkich próbek, w tym substancji testowych, kontroli pozytywnej i negatywnej, zmierzono na końcu końcowego odczytu (pH wynosiło 7,2 ± 0,2), aby wykluczyć wpływ kwasowości na aktywność enzymów. Użyliśmy dobrze przebadanych substancji kontrolnych pozytywnych: kwasu kojowego dla tyrozynazy (13), 1,10-fenantroliny dla kolagenazy i N-(metoksysukcynylo)-Ala-Ala-Pro-Val-chlorometyloketonu (SPCK) dla elastazy (14).
Badanie i obliczenia synergii
Mieszaninę TCA i kwasu mlekowego przetestowano w stosunku 1:2 (tak jak w testowanym produkcie do peelingu) pod kątem wyżej wymienionych aktywności hamujących enzymy. Wskaźnik synergii i redukcji dawki (DRI) zbadano metodą rozcieńczeń seryjnych o stałym stosunku i oprogramowaniem CompuSyn opracowanym przez Chou (15, 16).
Dokowanie molekularne in-silico
Aby wyjaśnić mechanizm hamowania tyrozynazy przez kwas mlekowy i trichlorooctowy, do dokowania molekularnego wykorzystano oprogramowanie Rosetta, a energię wiązania zgłoszono jako jednostkę energii Rosetta (REU). Do minimalizacji energii, usuwania kolizji i wizualizacji struktury wykorzystano oprogramowanie Chimera. Do obliczenia kieszeni/jam wiążących w białku wykorzystano serwer Active Site Prediction Server firmy IIT w Delhi. Przed zastosowaniem modelu dokowania dla kwasu mlekowego i TCA, jego solidność przetestowano najpierw na kwasie kojowym, kontroli pozytywnej i związku wzorcowym w dokowaniu molekularnym dla tyrozynazy. Przeprowadzono sekwencyjne dokowanie TCA i kwasu mlekowego, aby uzyskać wgląd w ich synergistyczne interakcje.
In vitro: 3D odpowiedniki ludzkiej skóry i qPCR
Pełnowymiarowe odpowiedniki ludzkiej skóry EpiDermFT 3D (MatTek Corp, USA) hodowano w pożywce EFT400 uzupełnionej czynnikami wzrostu, hormonami i prekursorami lipidów (MatTek Corp, USA). Ten model ludzkiej skóry został opracowany bioinżynieryjnie z wykorzystaniem keratynocytów naskórka i fibroblastów skóry właściwej od jednego zdrowego dawcy, tworząc wielowarstwowy model ludzkiego naskórka i skóry właściwej. Model charakteryzuje się aktywnością metaboliczną i mitotyczną oraz innymi cechami morfologicznymi i wzrostowymi, podobnymi do tych uzyskanych in vivo, niezbędnymi do badania właściwości przeciwstarzeniowych, gojenia ran, podrażnień skóry i wielu innych właściwości produktów kosmetycznych i medycznych (17–19). Przed badaniem peeling rozcieńczono do 10% roztworu; dawka ta okazała się nietoksyczna dla tkanek, co zostało potwierdzone testem Alamar Blue. Odpowiedniki skóry poddano działaniu buforu (kontrola) lub 10% roztworu peelingu przez 1 minutę. RNA wyizolowano ze skóry za pomocą zestawu RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Inc., USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, próbki skóry lizowano za pomocą buforu lizy dostarczonego w zestawie. Lizat przepuszczono przez kolumnę wirującą gDNA eliminator w celu usunięcia zanieczyszczeń DNA, a następnie przez kolumnę wirującą RNeasy Minielute w celu oddzielenia RNA, które ostatecznie eluowano wodą w kolejnym etapie syntezy cDNA. cDNA syntezowano za pomocą zestawu Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit z dsDNase (Thermo Scientific, USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, była to procedura dwuetapowa. Najpierw próbki RNA inkubowano z dsDNase (dołączoną do zestawu) w celu usunięcia genomowego DNA. Następnie do oczyszczonego RNA z etapu 1 dodano mieszaninę enzymów (odwrotna transkryptaza Maxima) i mieszaninę reakcyjną [dNTP, oligo(dt)18 i losowe startery heksamerowe]. Mieszaninę wirowano i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C, a następnie przez 15 minut w temperaturze 50°C, a na koniec reakcję zakończono, podgrzewając mieszaninę do 85°C przez 5 minut. cDNA przechowywano w temperaturze −80°C, chyba że był używany do qPCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Reakcję Rt-qPCR wykonano z użyciem systemu Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA) w celu ilościowego określenia różnicowej ekspresji (ΔCt) markerów genetycznych stanu zapalnego (interleukiny 1a, 6 i 8), uwodnienia/bariery (filagryna i klaudyna 1), regeneracji (czynnik wzrostu tkanki łącznej i insulinopodobny czynnik wzrostu 1) oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen 1A, kolagen 3A, elastyna i fibronektyna 1).
Ex vivo: Hodowla tkankowa i obróbka produktu
Biopsje ludzkiej skóry pocięto na próbki o wymiarach 8 × 3 mm (średnica × grubość). Próbki skóry zważono w celu wybrania próbek o zbliżonej masie. Próbki skóry hodowano na perforowanych pierścieniach ze stali nierdzewnej, które miały kontakt z modyfikowaną pożywką hodowlaną Williams E. Każdą próbkę skóry pokryto membraną o średnicy 6 mm, a następnie na membranę nałożono komercyjny roztwór peelingujący (płyn), aby uzyskać równomierne rozprowadzenie produktu na skórze. Produkt nakładano codziennie, a pożywkę hodowlaną wymieniano co 3 dni, aż do 6. dnia, kiedy to pobrano próbki skóry w celu sprawdzenia żywotności i przeprowadzenia pomiarów histochemicznych.
Żywotność skóry
Żywotność próbek skóry zbadano za pomocą testu z bromkiem 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowym (MTT). Płynny roztwór peelingujący testowano w rozcieńczeniach seryjnych: 1:1 (100% produktu wyjściowego), 1:2, 1:4 i 1:8, aby określić nietoksyczną dawkę peelingu do następnego etapu, czyli modulacji melaniny i kolagenu.
Model skóry ex vivo z kolagenem uszkodzonym przez światło
Aby ocenić skuteczność peelingu w leczeniu skóry uszkodzonej przez światło, przygotowano model skóry ex vivo z kolagenem uszkodzonym przez światło, stosując metodę opartą na indywidualnym kącie typologii (ITA) w celu przewidywania biologicznie skutecznej dawki promieniowania UV (BED-UV) (20). W skrócie, do naświetlania biopsji skóry (dawca w wieku 62 lat i o średnim typie skóry z ITA 37°) użyto BIO-SUN firmy Vilber Lourmat z promieniowaniem UV o natężeniu 6 J/cm². Aby odtworzyć warunki rzeczywiste, w 96% przypadków (21) zastosowano promieniowanie UVA (5,76 J/cm²) i UVB (0,24 J/cm²), co odpowiada oparzeniom słonecznym, ale bez uszkodzeń DNA (20). Stwierdzono, że promieniowanie BED-UV o natężeniu 6 J/cm² indukuje jedynie uszkodzenia kolagenu (ale nie pigmentację melaniny), dlatego w badaniu wykorzystano wyłącznie model skóry z kolagenem uszkodzonym przez światło.
Obrazowanie histochemiczne i półilościowa ocena
W każdej grupie leczonej (grupa nieleczona, grupa kontrolna dodatnia i grupa testowa z „peelem” po rozcieńczeniu 2x), biopsje skóry (N = 6) poddawano obróbce każdego dnia, a następnie pobierano 6. dnia do obróbki histochemicznej: cięcia na skrawki, a następnie barwienia i obrazowania. Dwa losowe skrawki z każdej biopsji poddano obrazowaniu i obróbce w celu uzyskania informacji statystycznych z N = 12 obrazów lub punktów danych dla każdej grupy leczonej. Do obrazowania melaniny skrawki barwiono barwnikiem Fontana-Masson (granulki melaniny w kolorze czarnym/brązowym/ciemnoszarym), a skrawki kolagenowe barwiono barwnikiem Picrosirius Red (włókna kolagenowe w kolorze fioletowo-czerwonym). Do ilościowego określenia zawartości melaniny i kolagenu w biopsjach skrawek zastosowano opatentowany algorytm i proces. W skrócie, obrazy poddano dekonwolucji w celu oddzielenia sygnałów od tła, na przykład kolagenu w kolorze czerwonym/fioletowym od tła bez kolagenu w kolorze niebiesko-zielonym. Surowe kolorowe obrazy RGB zostały przekonwertowane do 8-bitowej przestrzeni barw Lab za pomocą oprogramowania Image J firmy National Institute of Health. Przekształcone wartości L* zostały znormalizowane względem stosunku obszaru zaznaczonego do obszaru szkiełka, aby uzyskać wyniki pigmentacji i kolagenu.
Kontrole pozytywne
Kwas kojowy do oceny aktywności przeciwpigmentacyjnej (dokowanie molekularne in silico, test antytyrozynazy in vitro i hamowanie melaniny ex vivo), 1,10-fenantrolina do oceny antykolagenazy in vitro, retinol do oceny syntezy kolagenu ex vivo oraz SPCK do oceny antyelastazy in vitro.
Statystyka
W celu przeprowadzenia analizy statystycznej przeprowadzono co najmniej dwa niezależne eksperymenty dla wszystkich eksperymentów. Do testowania istotności danych in vitro zastosowano test t-Studenta. W celu oceny istotnych różnic między grupami przeprowadzono jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z testem permutacyjnym, a następnie testem Tukeya lub Dunnetta oraz testem t, a następnie testem permutacyjnym. Wartość p <0,05 została uznana za istotną różnicę.
Wyniki
Aktywność hamowania enzymów in vitro
Stwierdzono, że komercyjny peeling znacząco hamuje tyrozynazę (Rysunek 1A), kolagenazę (Rysunek 1B) i elastazę (Rysunek 1C) w sposób zależny od dawki. W porównaniu z kolagenazą i tyrozynazą, test elastazy miał stosunkowo wyższą powtarzalność (o czym świadczą wąskie paski błędów), ponieważ ten drugi był testem fluorescencyjnym, a dwa pozostałe oparte były na absorbancji. TCA i kwas mlekowy (aktywne składniki peelingu) zostały dodatkowo przetestowane jako nierozcieńczone roztwory w celu zbadania ewentualnej synergii. Stwierdzono, że TCA:kwas mlekowy w stosunku 1:2 wykazuje silną synergię w zakresie aktywności antytyrozynazowej (Rysunek 2A) i antykolagenazowej (Rysunek 2B). Jest to optymalny stosunek do osiągnięcia maksymalnej synergii, ponieważ zaobserwowaliśmy spadek synergii przy odchyleniu od tego stosunku. Wyniki uzyskane przy użyciu CompuSyn dodatkowo potwierdziły, że nie jest to efekt addytywny, lecz rzeczywista synergia między kwasem TCA:kwasem mlekowym w stosunku 1:2 w przypadku działania przeciwtyrozynazowego (Rysunek 2A, wstawka) i przeciwkolagenazowego (Rysunek 2B, wstawka). Intensywność zielonej linii na poligonogramach CompuSyn (wstawki) wskazuje na siłę synergii. Nie zaobserwowano synergii w przypadku działania przeciwelastazowego. Rysunek 2A i wyniki obliczeń z CompuSyn (Tabela uzupełniająca 1) sugerują, że kwas TCA ma niewielką lub żadną aktywność hamującą tyrozynazę, jednak kwas TCA ma kluczowe znaczenie dla synergii i może kilkukrotnie zmniejszyć dawkę kwasu TCA i kwasu mlekowego (oznaczoną jako „wskaźnik redukcji dawki” DRI w Tabeli uzupełniającej 1), aby osiągnąć ten sam poziom skuteczności (oznaczony jako „aktywność ułamkowa” Fa w Tabeli uzupełniającej 1).
Dokowanie molekularne in silico w celu wyjaśnienia mechanizmu hamowania tyrozynazy
Tyrozynaza jest kluczowym enzymem odpowiedzialnym za pigmentację. Struktura enzymu tyrozynazy i mechanizmy jego hamowania przez składniki wzorcowe, takie jak kwas kojowy i hydrochinon, w przypadku skóry hiper- i przebarwionej są dobrze scharakteryzowane (22).
Rysunek 2C przedstawia strukturę krystaliczną tyrozynazy. Miejsce katalityczne tyrozynazy (miejsce aktywne odpowiedzialne za produkcję melaniny z tyrozynazy) charakteryzuje się obecnością dwóch atomów miedzi, które są niezbędne do katalitycznej aktywności enzymu. Nałożenie natywnego kwasu kojowego z odzyskanym kwasem kojowym (Rysunek uzupełniający 1A) oraz podobieństwo ich energii wiązania i reszt wiążących (Tabela 1) z wcześniejszymi doniesieniami potwierdzają solidność naszego modelu (13, 22). Ten zwalidowany model został użyty do dokowania TCA, kwasu mlekowego i ich sekwencyjnego dokowania. Kwas kojowy wykazuje najwyższe powinowactwo do hamowania tyrozynazy (−6,686 REU), następnie kwas mlekowy (−5,496 REU) i kwas TCA (−2,149 REU) (Tabela 1). W porównaniu z kwasem kojowym i mlekowym, które wiążą się w miejscu katalitycznym (Rysunek 2C) i mają tę samą wnękę hydrofobową (Rysunek uzupełniający 1B), kwas TCA wykazywał maksymalne powinowactwo w miejscu oddalonym od miejsca katalitycznego (Rysunek 2C). Co zaskakujące, po sekwencyjnym dokowaniu kwasu mlekowego i TCA zaobserwowano zmianę jego struktury z liniowej na pierścieniową (Rysunki uzupełniające 1C, D). Ta zmiana w strukturę pierścieniową może być przyczyną synergistycznego działania TCA i kwasu mlekowego i wymaga dalszych badań.
Model trójwymiarowej skóry ludzkiej in vitro
Stwierdzono, że komercyjny roztwór peelingujący nie wywiera istotnego wpływu na hamowanie metabolizmu bioinżynierowanego trójwymiarowego modelu skóry ludzkiej. Nie zaobserwowano istotnej zmiany (zmiana krotności <2) w ekspresji IL-6, IL-8, IL-1a, FLG i CLDN1 między skórą poddaną peelingowi a skórą poddaną działaniu buforu. Brak zmian w tych genetycznych markerach stanu zapalnego i bariery skórnej wskazuje na łagodny charakter peelingu i brak niekorzystnej reakcji biologicznej. Jednakże zaobserwowano co najmniej dwukrotny wzrost stężenia COL1A, FN1, COL3A, ELN, CTGF i IGF1 (dane nieprzedstawione). Wzrost stężenia tych składników ECM (kolagenu, elastyny i fibronektyny) oraz czynników wzrostu (CTGF i IGF1) potwierdza mechanizm działania peelingu, który przeciwdziała starzeniu się skóry i ją regeneruje.
Biopsja człowieka ex vivo
Produkt do peelingu dostępny w sprzedaży został przetestowany w stężeniu 50% (rozcieńczenie 2x produktu dostępnego w sprzedaży), ponieważ stwierdzono, że nie hamuje on aktywności metabolicznej biopsji ludzkich w tym stężeniu (Rysunek uzupełniający 2). Rysunek 3 przedstawia obrazy skrawków skóry po barwieniu metodą Fontana-Masson w celu obrazowania melaniny i półilościowego określenia zawartości melaniny (czarne/ciemnoszare granulki) w skórze: skóra nieleczona w porównaniu z leczoną produktem lub kontrolą pozytywną (kwas kojowy). Wyraźnie widoczna jest integralność struktury skóry i liczebność komórek zawierających melaninę w warstwie podstawnej naskórka. Po zastosowaniu peelingu (50% roztwór) i kontroli pozytywnej (0,1% kwas kojowy) obserwuje się wyraźny spadek intensywności czerni/ciemnoszarej granulki melaniny. Podobne obserwacje poczyniono we wszystkich sześciu różnych próbkach/fragmentach skóry badanych dla każdego schorzenia. Tabela uzupełniająca 2 przedstawia wyniki/wartości melaniny z pięciu biopsji, po dwa fragmenty z każdej biopsji (z wyłączeniem dwóch odstających punktów z szóstej biopsji) dla każdego stanu leczenia. Zaobserwowano istotną zmianę, odpowiednio o -11% i -24%, w wynikach pigmentacji (zawartości melaniny) skóry po leczeniu peelingiem i kwasem kojowym (ryc. 3D).
Wnioski i dyskusja
Peeling chemiczny należy do najczęstszych niechirurgicznych zabiegów estetycznych, których średni koszt wynosi około 644 dolarów amerykańskich (USD) w przeliczeniu na honorarium lekarza/chirurga, a łączne wydatki sięgają około 900 milionów dolarów (1). Kwasy TCA i AHA to główne składniki peelingów chemicznych, stosowanych jako standard w leczeniu szerokiego spektrum schorzeń skóry, takich jak dyschromia pigmentacyjna, fotostarzenie, melasma itp. (3). Kwas TCA jest dobrze znany ze swojego działania żrącego (4), natomiast kwasy AHA mają właściwości złuszczające (6). Jednak niewiele wiadomo na temat aktywności kwasu TCA poza jego działaniem żrącym. Ponadto interakcja kwasu TCA z kwasami AHA jest nieznana, pomimo istotnego znaczenia, jakie ma fakt, że wiele peelingów chemicznych dostępnych na rynku zawiera te kwasy. W naszych badaniach przeanalizowaliśmy komercyjny peeling z dodatkiem kwasu mlekowego i TCA, aby zrozumieć mechanizm jego działania w leczeniu skóry fotostarzejącej się i z przebarwieniami. Wykorzystaliśmy najnowocześniejsze metody in vitro, in silico i ex vivo, aby uzyskać jasne zrozumienie mechanizmu działania peelingu i jego głównych składników aktywnych – kwasu trójchlorooctowego (TCA) i kwasu mlekowego.
Stwierdziliśmy, że peeling silnie hamuje tyrozynazę, kolagenazę i elastazę, enzymy odpowiedzialne odpowiednio za produkcję pigmentu melaniny oraz degradację kolagenu i elastyny (Rysunek 1). Co zaskakujące, TCA i kwas mlekowy, główne składniki aktywne peelingów, wykazują silną synergię antytyrozynazy i antykolagenazy w stosunku zastosowanym w peelingu, tj. TCA:kwas mlekowy w stosunku 1:2 (Rysunki 2A, B). Te zaskakujące odkrycia zmotywowały nas do wykorzystania narzędzi obliczeniowych w celu wyjaśnienia mechanizmu hamowania i symulacji wpływu tej synergii na bezpieczeństwo i skuteczność produktów. Ten synergistyczny efekt może zmniejszyć dawkę kwasu mlekowego kilkukrotnie, jeśli jest stosowany z TCA w stosunku 1:2 (TCA:mlekowy), aby osiągnąć tę samą skuteczność. Na przykład (Tabela uzupełniająca 1), aby osiągnąć 90% skuteczność antytyrozynazową, wymagane jest 2,4% kwasu mlekowego, gdy jest stosowany samodzielnie, jednak będzie to 4,24-krotnie mniej kwasu mlekowego (0,56%), aby osiągnąć tę samą 90% skuteczność, jeśli do 0,56% roztworu kwasu mlekowego zostanie dodane co najmniej 0,25% TCA. Zmniejszenie dawki dzięki synergii kwasu mlekowego i TCA jest pomocne w minimalizowaniu skutków ubocznych peelingu chemicznego, ponieważ są one wysoce kwaśne i mają działanie żrące (23, 24). Ten symulowany wskaźnik redukcji dawki (DRI) przez CompuSyn ma implikacje medyczne, aby pomóc lekarzom w wyborze bezpiecznej dawki w ich badaniu klinicznym (15). Uzasadnieniem synergii między kwasem TCA a kwasem mlekowym może być zmiana struktury z liniowej na pierścieniową, którą zaobserwowaliśmy podczas sekwencyjnego dokowania obu składników tyrozynazą (rysunki uzupełniające 1C, D). Obecnie naukowcy i przemysł odchodzą od tradycyjnego podejścia „jeden lek – jeden cel – jedna choroba” w procesie odkrywania leków na rzecz silniejszego podejścia synergistycznego (25). Przykładami niektórych synergistycznych mieszanin zawierających składniki aktywne, w tym te stosowane w peelingach chemicznych o działaniu antytyrozynazowym lub przeciwprzebarwieniowym, są kwas kojowy i hydrochinon (26), rezorcyna, resweratrol, glabrydyna (25), rezorcyna i bisabolol (27) itp.
Ponadto, peeling nie wywołał istotnych zmian w ekspresji biomarkerów genetycznych stanu zapalnego (IL 1a, 6, 8) ani bariery skórnej (FLG, CLDN1). Zamiast tego zwiększyła ekspresję genetyczną składników ECM i czynników wzrostu, które wspomagają mechanizm działania peelingu związany z przeciwstarzeniowym i regenerującym skórę.
Promieniowanie UVA jest związane z fotostarzeniem skóry, podczas gdy UVB z oparzeniami słonecznymi (28). Dlatego też, aby symulować rzeczywiste warunki UV dla modelu fotostarzenia ex vivo, próbki biopsji ludzkiej skóry wystawiono na działanie 6 J/cm² BED światła dziennego UV, składającego się w 96% z UVA i 4% z UVB (21), które wywołało oparzenie słoneczne/rumień, ale nie uszkodzenie DNA (20). Degradacja kolagenu po wystawieniu na działanie BED UV, a następnie naprawa tego uszkodzonego przez UV kolagenu przez peeling i pozytywną kontrolę retinolu (rycina 4) potwierdza korzyści ze stosowania peelingu. Nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi raportami dotyczącymi wykorzystania UVA i UVB w badaniu fotostarzenia, chociaż warunki były nierealne, ponieważ stosunek UVB do UVA wynosił 4:1 (29).
Podsumowując, odkryliśmy podwójny mechanizm działania peelingu z kwasem mlekowym z dodatkiem TCA. Po pierwsze, peeling hamuje enzymy odpowiedzialne za degradację składników ECM (kolagenu i elastyny), chroniąc w ten sposób naturalną ECM obecną w naszej skórze. Po drugie, peeling indukuje ekspresję genów odpowiedzialnych za syntezę składników ECM i czynników wzrostu, stymulując regenerację skóry, bez żadnych skutków ubocznych dla integralności bariery skórnej i stanów zapalnych. Peeling był w stanie naprawić kolagen uszkodzony przez promieniowanie UV i zahamować pigmentację melaniny w biopsjach skóry. Odkryliśmy również synergistyczne działanie aktywnych składników TCA i kwasu mlekowego obecnych w peelingu, co może wynikać ze zmiany ich konformacji z liniowej na pierścieniową. To synergistyczne działanie ma implikacje dla peelingów chemicznych (i medycyny ogólnie) w celu opracowania bezpiecznej i skutecznej terapii poprzez zmniejszenie dawki składników aktywnych.
ŹRÓDŁA:
- 1.The American Society of Plastic Surgeons . Plastic Surgery Statistics Report. (2019). Available online at: https://www.plasticsurgery.org/documents/News/Statistics/2019/plastic-surgery-statistics-full-report-2019.pdf (accessed August 11, 2020).
- 2.The American Society for Aesthetic Plastic Surgery . Aesthetic Plastic Surgery National Databank Statistics. (2019). Available online at: https://www.surgery.org/sites/default/files/Aesthetic-Society_Stats2019Book_FINAL.pdf (accessed August 11, 2020).
- 3.Soleymani T, Lanoue J, Rahman Z. A practical approach to chemical peels. J. Clin. Aesthet. Dermatol. (2018) 11:21–8. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Obagi S, Niamtu J. Chemical peel. In: Niamtu J. editor. Cosmetic Facial Surgery, 2nd ed. Elsevier; (2018). p. 732–55. 10.1016/B978-0-323-39393-5.00014-5 [DOI] [Google Scholar]
- 5.Tang SC, Yang JH. Dual effects of alpha hydroxy acids on the skin. Molecules. (2018) 23:863. 10.3390/molecules23040863 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.The Food and Drug Administration . Alpha Hydroxy Acids. (2019). Available online at: https://www.fda.gov/cosmetics/cosmetic-ingredients/alpha-hydroxy-acids (accessed June 25, 2019).
- 7.Liu H, Khachemoune A, Rashid RM. Chemical burn following 50% trichloroacetic acid for acne: presentation of a case and a focused review. J Dermatol Dermatol Surg. (2016) 20:71–4. 10.1016/j.jdds.2015.06.001 [DOI] [Google Scholar]
- 8.Dayan E, Rohrich RJ. Jessner’s solution with trichloroacetic acid chemical peel: optimizing outcomes and safety. Int Open Access J Am Soc Plast Surg. (2019) 7:e2250. 10.1097/GOX.0000000000002250 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Nguyen TH, Rooney JA. Trichloroacetic acid peels. Dermatol Ther. (2000) 13:173–82. 10.1046/j.1529-8019.2000.00020.x [DOI] [Google Scholar]
- 10.Kligman DE, Draelos ZD. Combination superficial peels with salicylic acid post peel retinoids. J Drugs Dermatol. (2016) 15:442–50. [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Briden ME. Alpha hydroxyacids chemical peeling agents: case studies and rationale for safe and effective use. Cutis. (2000) 73:18–24. [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Babilas P, Knie U, Abels C. Cosmetic and dermatologic use of alpha hydroxyl acids. J German Soc Dermatol. (2012) 10:488–91. 10.1111/j.1610-0387.2012.07939.x [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Jung HJ, Noh SJ, Park Y, Kang D, Chun P, Chung HY, et al. In-vitro and in-silico insights into tyrosinase inhibitors with (E)-benzylidene-1-indanone derivatives. Comput Struct Biotechnol J. (2019) 17:1255–64. 10.1016/j.csbj.2019.07.017 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Pientaweeratch S, Panapisal V, Tansirikongkol A. Antioxidant, anti-collagenase and anti-elastase activities of Phyllanthus embilica, Manilkara zapota and silymarin: an in-vitro comparative study for anti-aging applications. Pharm Biol. (2016) 54:1865–72. 10.3109/13880209.2015.1133658 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res. (2010) 70:440–6. 10.1158/0008-5472.CAN-09-1947 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Zhang N, Fu JN, Chou TC. Synergistic combination of microtubule targeting anticancer fludelone with cytoprotective panaxytrio derived from panax ginseng against MX-1 cells in-vitro: experimental design and data analysis using the combination index method. Am J Cancer Res. (2016) 6:97–104. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Xiong ZM, O’Donovan M, Sun L, Choi JY, Ren M, Cao K. Anti-aging potentials of methylene blue for human skin longevity. Sci Rep. (2017) 7:2475. 10.1038/s41598-017-02419-3 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Lee ES, Ahn Y, Bae IH, Min D, Park NH, Jung W, et al. Synthetic retinoid seletinoid G improves skin barrier function through wound healing and collagen realignment in human skin equivalents. Int J Mol Sci. (2020) 21:3198. 10.3390/ijms21093198 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Mallampati R, Patlolla RR, Agarwal S, Babu RJ, Hayden P, Klausner M, et al. Evaluation of Epiderm full thickness 300 (EFT-300) as an in-vitro model for skin irritation: studies on aliphatic hydrocarbons. Toxicol In Vitro. (2010) 24:669–76. 10.1016/j.tiv.2009.08.019 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Bino SD, Sok J, Bessac E, Bernerd F. Relationship between skin response to ultraviolet exposure and skin color type. Pigment Cell Res. (2006) 19:606–14. 10.1111/j.1600-0749.2006.00338.x [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.D’Orazio J, Jarrett S, Ortiz AA, Scott T. UV radiation and the skin. Int J Mol Sci. (2013) 14:12222–48. 10.3390/ijms140612222 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Deri B, Kanteev M, Goldfeder M, Lecina D, Guallar V, Adir N, et al. The unraveling of the complex pattern of tyrosinase inhibition. Sci Rep. (2016) 6:34993. 10.1038/srep34993 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Rakic L, Lapiere CM, Nusgens BV. Comparative caustic and biological activity of trichloroacetic and glycolic acids on keratinocytes and fibroblasts in-vitro. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. (2000) 13:52–9. 10.1159/000029908 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Dayal S, Sahu P, Yadav M, Jain VK. Clinical efficacy and safety on combining 20% trichloroacetic acid peel with topical 5% ascorbic acid for melasma. J Clin Diagn Res. (2017) 11:WC08–11. 10.7860/JCDR/2017/26078.10685 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Wang Y, Hao MM, Sun Y, Wang LF, Wang H, Zhang YJ, et al. Synergistic promotion on tyrosinase inhibition by antioxidants. Molecules. (2018) 23:1–13. 10.3390/molecules23010106 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 26.Deo KS, Dash KN, Sharma YK, Virmani NC, Oberai C. Kojic acid vis-à-vis its combinations with hydroquinone and betamethasone valerate in melasma: a randomized, single blind, comparative study of safety and efficacy. Indian J Dermatol. (2013) 58:281–5. 10.4103/0019-5154.113940 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 27.Trunet A, Meyer I, Maire ML, Vielhaber GL. A Skin and/or Hair Whitening Mixture. Patent application number 13182603.4. European Patent Office, (2015). [Google Scholar]
- 28.Kong BY, Sheu SL, Kundu RV. Assessment of consumer knowledge of new sunscreen labels. JAMA Dermatol. (2015) 151:1028–30. 10.1001/jamadermatol.2015.1253 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 29.Kim HK. Garlic supplementation ameliorates UV-induced photoaging in hairless mice by regulating antioxidative activity and MMPs expression. Molecules. (2015) 21:70. 10.3390/molecules21010070 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]